1樓：小蝸牛聽風看雨
1、畢赤酵母菌菌落pcr混合液（通俗稱為pcr mix）的製備
taq buffer（10×） 180ul
dntp（2.5 mm） 20～25 ul
primer forward（引物濃度在10pmol） 5 ul
primer reverse（引物濃度在10pmol） 5 ul
ddh2o 720 ul
taq（2u/ul） 12～15 ul
2、常溫下隨機挑選平板內的長勢較好的單一菌落，用滅菌的牙籤或槍頭挑取單一菌落（強調單一，不能是雙克隆），在lb瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然後將沾有菌體的牙籤或槍頭置於相應的pcr8聯管中或者96孔pcr反應板中（96孔反應板和挑選的菌落做好記號，如平板上點的是1#，2#，3#……則96空反應板也相應標1#，2#，3#……以便篩選到克隆後的擴大培養），再將挑取的96個單一菌落轉移到48孔板培養基中培養，挑好單克隆菌落轉移之後，由於96孔反應板內沾有挑選的菌落，可以用相應的通用引物和之前配製好的pcr混合液混合好之後加入到96孔反應板內。
3、將混有菌體的pcr混合物置於pcr儀中，按常規條件擴增。
4、在擴增出來的反應液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。
5、將已經篩選到的陽性克隆對應96孔反應板上的菌株挑選出來，37度繼續培養達到一定時間可以抽提質粒，測序驗證是否是需要的目的基因
注意事項：設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pet系列可用t7通用引物。
如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連線），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑑定了，而且錯誤概率很低。pcr條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。
使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的迴圈數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的gc含量問題，有的gc含量很低，有的又很高，導致菌落pcr不容易擴增出目的條帶，在此建議在設定pcr程式時以高gc的溫度為上限，每一迴圈降0.2度左右。
2樓：上賊船莫怕死
用搖的菌液，試劑盒提取酵母菌的dna後，再取0.5-1ul做驗證，這樣成功機率會比較高。因為菌液pcr的話，模板的量是無法控制的。模板濃度太大的話，也會導致無法獲得陽性條帶。
1.用滅菌牙籤挑單克隆到10ul無菌去水中；
2.加5ul（5u /ul）的溶細胞酶（推薦sigma的）；
3.37度水浴半小時；
4.-80度靜置15分鐘；
5.沸水中煮沸5分鐘；
6.12000rpm離心5分鐘；
7.取上清0.5-1ul到25ulpcr反應體系
3樓：手機使用者
酵母細胞的細胞壁主要成分為多糖（85%-90%）和蛋白質（10%-15%），其中多糖是由甘露聚糖、β-葡聚糖和少量的幾丁質等組成，處於細胞壁內層的β-葡聚糖與幾丁質共價相連，起到細胞骨架的作用。
總的來說，鹼裂解法以及利用蝸牛酶消化和水煮沸法運用得當，模板處理差別不會太大，pcr效果基本相當，最後我們還是選用了先凍存然後水煮沸的方法，相比較其他方法，簡單方便快捷，更加有利於實驗進行。而外層的甘露聚糖與中層蛋白質中的絲氨酸或蘇氨酸以o-糖苷鍵相連線，形成的甘露糖蛋白覆蓋在細胞的表面，給與酵母細胞一定的韌性。為了提高pcr鑑定的成功率，一定要對酵母細胞進行充分的破壁處理。
首先挑取單克隆到500ul培養基中，待克隆搖起來，選取搖的菌液300ul，12000rpm離心 2分鐘，棄去上清液；再加取等體積的滅菌雙蒸水300ul重選沉澱洗一次，12000rpm離心 2分鐘，棄去上清液，然後再加入50ul 滅菌雙蒸水，重選菌體沉澱，然後負二十度或者負八十度凍存2小時或者過夜都可以。然後室溫融化，在沸水中煮沸10分鐘；12000rpm離心 2分鐘，取1ul 上清液作為模板，加入pcr體系，按照pcr正常程式即可。
畢赤酵母表達載體和大腸桿菌的區別
4樓：匿名使用者
由於甲醇營養型酵母菌體內無天然質粒，所以攜帶外源基因的重組體必須整合於染色體回中才能實答現外源基因的表達。整合表達的優點在於保持外源基因穩定性並可產生多拷貝基因。典型的畢赤氏酵母表達載體含有醇氧化酶基因的調控序列
酵母菌落pcr怎麼做
5樓：北京索萊寶科技****
菌落pcr就是直接用懸浮的菌液作為pcr的模板加上primer dntp和酶 buffer直接搞pcr
pcr的條件要有所改變
我的經驗是把第一步的保溫時間延長到20min,可以破壞掉細胞.
然後迴圈的時間照舊.
（僅供參考）
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