1樓：南京金益柏生物科技****
建議樓主產看文獻
***/link?url=zf7lnaeihra-1uj00sxtt9ywo1_mvbhkml-t2sfeyq4zojisfkchnn_wtk3cslht0avucljxdbkwk6jg6efkqyb-qpsjbfaiuqi13l-h703 這個文獻可以參考下
請教免疫熒光雙標中熒光二抗的選擇是否合適
2樓：南京金益柏生物科技****
一般來說,選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：
1.二抗應選用與使用的一抗相同的物種**;
2.二抗需與一抗的類別或亞類相匹配.這通常是針對單克隆抗體而言.多克隆抗體主要是igg類免疫球蛋白,因此相應的二抗就是抗igg抗體;
3.一般來說,不同的種屬**與二抗的質量沒有必然的聯絡,**于山羊的二抗與**於驢的二抗在一般的實驗裡沒有太多的差別.然而在一些特殊的實驗裡, 如雙標實驗裡,如果其中一個一抗是山羊**的,一個是小鼠**的,則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗,這時候,二抗就不能選擇山羊或者小鼠**的.
3樓：闞爽姓彥
免疫熒光法雙標法我自己到沒做過，不過我一同學在威斯騰生物做過免疫熒光雙標
免疫熒光的方法有什麼注意環節
4樓：南京金益柏生物科技****
1、冰凍切片製備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原彌散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2、組織切片固定：切好片風乾後立即用冰丙酮等固定液進行固定 5-10 min，尤其要較長時間儲存的白片，一定要及時固定和適當儲存。
3、血清封閉：為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗**一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般 10-30 min。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或 37℃ 立即觀察，若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 30 min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。
最後，熒光素標記的二抗隨著儲存時間的延長，可能後有大量的遊離熒光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6、復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用 dapi 復染。
7、封片：為了長期儲存，我們一般用緩衝甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷彌散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是 3 min*3 次，而一抗孵育後的清洗均為 5 次*5 min。注意：
單獨沖洗，防止交叉反應造成汙染。溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。
pbs 的 ph 和離子強度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議 ph 在 7.4-7.
6 濃度是 0.01 m。（中性及弱鹼性條件（ph7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解）
9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和溼度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程式；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2 h 為宜，超過 90 min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱；標本受紫外線照射 3~5 min 後，熒光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生熒光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過 2~3 h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。
天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
關閉汞燈至少在開啟 15-30 分鐘後；標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中 4℃ 儲存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
免疫熒光雙標兩種一抗可以一起加嗎
5樓：北京索萊寶科技****
一抗種屬不同的情況下，免疫熒光雙標兩種一抗可以一起加：
容易起交叉反應的是二抗，因為二抗會對igg有反應。而一抗是針對特異蛋白表位的。並不是針對igg的。
免疫熒光實驗方法（連續雙標法）
石蠟切片
1)烘片
▷在60℃烘箱放置2-4小時，使蠟流失。
2)脫蠟、脫水
▷二甲苯溶液中脫蠟，2次，每次5min
▷100%乙醇，2次，每次3min
▷95%乙醇，1次，每次3min
▷90%乙醇，1次，每次3min
▷85%乙醇，1次，每次3min
▷h2o，1次，每次3min
3)固定
▷樣本切片在冰的甲醇中放置10min (甲醇溶液在-80℃預冷)
▷用冰的pbs溶液洗2次，每次3min (pbs溶液在-20℃短暫預冷)
4)透化
▷用含0.25%triton x-100的pbs孵育石蠟切片10min (200mlpbs+500ul triton x-100)
▷用pbs溶液洗3次，每次5min
5)第一熒游標記
▷用pbst配置1%的bsa封閉液，將切片在封閉液中孵育1h
▷4℃冰箱，一抗過夜
▷用槍吸走一抗液體，pbs溶液洗3次，每次5min
▷二抗室溫1h
▷用槍吸走二抗液體，pbs溶液洗3次，每次5min（避光條件下進行）
6)第二熒游標記
▷4℃冰箱，一抗過夜
▷用槍吸走一抗液體，pbs溶液洗3次，每次5min
▷二抗室溫1h
▷用槍吸走二抗液體，pbs溶液洗3次，每次5min（避光條件下進行） 7)dapi對比染色
▷2µg/ml的dapi，15min
▷用pbs沖洗3次
8)封片
▷用移液槍吸中性樹脂一小滴，蓋上蓋玻片，用指甲油塗抹邊緣，待風乾後顯微鏡照相
免疫熒光染色與活死染色可以一起做嗎
6樓：南京金益柏生物科技****
免疫熒光染色方法快捷,靈敏.
標本是冰凍切片,還是石蠟切片?切片的厚薄?影響到一抗孵育的時間.
選用較佳的一抗的工作濃度.
二抗需a液b液在室溫混合15分鐘後再用.
標本需儲存在-20度.
求助：免疫熒光染色用什麼封片
7樓：南京金益柏生物科技****
你可以用甘油封片（甘油：pbs=1：1），然後與和樹膠封片一樣，但要注意擦乾周圍，熒光顯微鏡觀察。
求助免疫熒光的結果分析,求助免疫熒光PI染核問題
可以用image pro plus分析灰度 求助免疫熒光pi染核問題 細胞試驗指南上dapi染核是在孵育完二抗之後，估計pi也可以在這時加。在論壇中查到的濃度不一，有10 50 m，有5ug 20ug ml,作用時間有5 30min不等，染完後pbs洗3遍，封片。用535 nm激發波長，615 nm...
免疫熒光的標本怎麼製作,免疫熒光染色的詳細步驟及應注意的細節
免疫熒光的標本製作的基本程式和dab顯色的組化類似 1 免疫熒光不需要使用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其它相同2 免疫熒光的二抗使用不同熒游標記的二抗孵育，孵育時間根據抗體的工作濃度確定 3 二抗孵育之後充分洗片後即可貼片 封片和觀察4 免疫熒光在封片使用專用封片劑 如果你經費比較充足 或甘油 0....
細胞免疫熒光，求助,求助細胞免疫熒光的詳細操作步驟
細胞爬片免疫熒光實驗步驟 第一天 1.在培養板中將已爬好細胞的玻片用pbs浸洗3次，每次3min 2.用4 的多聚甲醛固定爬片15min，pbs浸洗玻片3次，每次3min 3.0.5 triton x 100 pbs配製 室溫通透20min 細胞膜上表達的抗原省略此步驟 4.pbs浸洗玻片3次，每次...