基因組重測序有哪些步驟?每個步驟的目的是什麼

2021-03-06 23:52:08 字數 5033 閱讀 5033

1樓:

這個問題要是能夠完美回答就沒有那麼多國內外生物學家仍在努力奮鬥了。事實上,全基因測序得到就如一本「天書」,我們還是像以前那樣,比如研究某個基因,任然要做很多實驗,各個層次的,分子的蛋白的,研究基因產物的功能結構,和別的蛋白質的關係,受什麼影響,細胞定位如何(遺傳學和分子生物學)。但是有了基因組測序的方便之處也有很多,比如我們很容易去找到這個基因所在位置,是否有突變,在生信方面可以**其結構、功能,找同源基因,系統發育樹等(生物資訊學),對於低階的模式生物,甚至可以建整個基因組、蛋白組、代謝組的網路(系統生物學),用於研究高通量資料等等。

總之,想回答這個問題,得深入學習我上面提到的學科,並研究下現在的科研文獻,才能較為全面的瞭解。不過看你想知道的深度了。

2樓:通資查元

基因組,genome,一個細胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列,包括全套基因和間隔序列。可是基因組測序的結果發現基因編碼序列只佔整個基因組序列的很小一部分。因此,基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部dna分子。

說的更確切些,核基因組是單倍體細胞核內的全部

dna分子。線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部dna分子。葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部dna分子。

中國研究人員成功破譯高山倭蛙基因組,是迄今為止破譯的首個現代蛙類基因組。

基因組重測序有哪些步驟?每個步驟的目的是什麼

3樓:愛我家菜菜

基因組,genome,一個細胞或者生物體所攜帶的一套完整的單倍體序列,包括全套基因和間隔序列。可是基因組測序的結果發現基因編碼序列只佔整個基因組序列的很小一部分。因此,基因組應該指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部dna分子。

說的更確切些,核基因組是單倍體細胞核內的全部 dna分子。線粒體基因組則是一個線粒體所包含的全部dna分子。葉綠體基因組則是一個葉綠體所包含的全部dna分子。

中國研究人員成功破譯高山倭蛙基因組,是迄今為止破譯的首個現代蛙類基因組。

基因測序的步驟是什麼?

4樓:匿名使用者

pcr產物直接測序技術現已成為分子生物學和基因組學研究中的一個重要技術,廣泛用於基因突變檢測、遺傳性疾病診斷、單核苷酸多型性研究、基因組重疊序列群等。與傳統克隆測序技術相比較,直接對pcr擴增的dna進行測序,省去了耗時的克隆步驟,避免了傳統的細菌培養,模板提取等重複性操作,可以從少量的原始樣品中得到正確的dna序列資訊。pcr產物直接測序技術具有快速、簡便、穩定經濟的優點。

試驗試劑

pcr擴增的雙鏈dna模板

長約20個核苷酸的dna引物

dna聚合酶

測序膠0.1mol/l ddt

α-32p-datp

dntp/ddntp混合物(80μmol/l/8μmol/l)

dntp(dctp、dgtp 、dttp 各0.75μmol/l)

測序反應緩衝液:40mmol/l tris-hcl(ph7.5),20mmol/l mgcl2,50mmol/l nacl

終止緩衝液:95% 甲醯胺,20mmol/l edta,0.05% 溴酚藍,0.05% 二甲苯腈

試驗步驟:

1、 4個微量離心管中各加入dntp/ddntp混合物2.5μl,混合物37oc溫浴5min,備用。

2、 在一個空的微量離心管中加入1pmol的pcr擴增雙鏈dna,10pmol測序引物,2μl 5×測序緩衝液,加雙蒸水至總體積10μl,96oc加熱8min,冰浴泠卻1min,4oc 10000g離心10s。

3、 加入2μl預冷的標記混合物(dctp、dgtp 、dttp 各0.75μmol/l),α-32p-datp 5μci,1μl 0.1mol/l ddt,測序酶2u,加水至15μl,混勻後置冰上2min,標記新合成的dna鏈。

4、 在第1步驟的4個管中各加入3.5μl標記反應混合物,37oc溫浴5min。每管各加入4μl終止液。

5、 樣品在80oc的水浴中熱變性5min,每一泳道加2μl 加到測序膠上,電泳分離這些片段。

注意事項:

1.??pcr產物要有一定的長度(>200bp),因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰圖的準確性較低。

2.??純化pcr產物可通過離子交換層析使擴增的dna段與反應剩餘的dntp及引物分離;也可通過瓊脂糖凝膠電泳,將pcr產物與非特異性擴增產物和引物分離開來;如果擴增的特異性較高時,可直接通過酚:氯仿抽提,乙醇沉澱的方法來純化。

3.??測序引物設計原則類似於pcr引物設計,可在dna合成儀上合成20個左右的核苷酸作為引物,經過高壓液相層析或聚丙烯醯胺凝膠電泳純化後,即可用作測序引物。

pcr迴圈測序法

pcr迴圈測序法是將pcr擴增和核酸序列分析技術相結合,從而形成的一種測定核苷酸序列的研究方法,也稱作線性擴增測序。該方法採用pcr儀加熱使dna模板變性,在taqdna聚合酶作用下,以溫度迴圈模式在模板上進行多輪的雙脫氧核苷酸測序反應,線性擴增標記的dna分子。

pcr迴圈測序法與以往的測序方法相比,其優點在於:大大減少所需的模板量;能提高測序反應產生的訊號,降低了操作的複雜性,且聚合酶的用量減少;可在小量製備的模板上進行篩選反應;高溫下進行的測序反應使dna聚合酶催化的聚合反應能夠通過模板二級結構的區域;雙鏈閉環dna可以直接作為反應模板應用,不用作預先鹼變性處理。由於pcr迴圈測序法能夠簡單、快速地檢測特定序列,因此, pcr迴圈測序法在核酸序列分析研究中受到廣泛的重視。

試驗試劑:

dna測序試劑盒

dntp

ddntp

丙烯醯胺

雙丙烯醯胺

尿素temed(n,n,n『,n』-四甲基乙二胺)

過硫酸銨

6%測序膠:6%丙烯醯胺,7mmol/l 尿素,1×tbe。

10×測序緩衝液:100mmol/l tris-hcl(ph8.8),500mmol/l kcl,40mmol/l mgcl2,0.

01%明膠,20μmol/l datp,50μmol/l dctp,50μmol/l dgtp,50μmol/l dttp

終止混合液:ddatp (600μmol/l),ddctp (600μmol/l),ddgtp (100μmol/l),ddttp(1000μmol/l)

終止緩衝液:95%甲醯胺,20mmol/l edta,0.05%溴酚藍,0.05%二甲苯腈

試驗步驟

1、 4個小離心管,每個小管加入3μl的終止混合液,將管子放在冰上。

2、 在dna模板中加入引物(4pmol), 4μl 10×測序緩衝液, 10μlα-32p-datp, 2u taqdna聚合酶,加雙蒸水到30μl徹底混勻,每管7μl加入上面4個小管中。

3、 反應液上加30μl的石蠟油。

4、 95oc 30s,50oc 30s,72oc 60s共30個迴圈,可根據具體的情況進行適當的調整迴圈條件及迴圈次數。

5、 反應結束後在油層下加入5μl的終止緩衝液並用加樣槍混勻。

6、 上樣前將樣品在大於80oc的水浴中熱變性5min,每一道加2μl加到測序膠上,電泳分離這些片段。

注意事項:

1、 製備測序模板:pcr 擴增的產物可以經過低熔點的瓊脂糖凝膠電泳純化**後,用於序列分析;可經過柱層析純化,去除pcr 反應後剩餘的dntp和引物後,用於序列分析。pcr 產物也可不經純化直接用於測序,但是這種測序產生的結果較差,建議測序之前應進行pcr產物的純化。

各種標準的質粒製備方法所純化出的質粒均可作為測序模板使用。用標準方法制備的m13噬菌體、粘粒、λdna都適合用作測序模板用。但要注意的是反應體系中不應有與引物互補的非目的基因序列,否則將會導致測序實驗的失敗。

2、 測序引物:測序引物是指合成的與測序模板鏈特異性互補的寡核苷酸序列。可用α-32p-datp和t4多聚核苷酸激酶對引物的5『端進行標記,反應體系中引物、激酶和α-32p-datp要保持在最佳的比例,以得到高比活性的標記引物;也可用α-32p-datp標記新合成的dna鏈。

引物的濃度不宜高,否則容易形成引物二聚體,或產生非特異性的擴增引物。

3、 酶:各種缺乏3『—5『端外切活性的耐熱dna聚合酶都可以用於迴圈測序,其中taqdna聚合酶在dna測序中最為常用。雖然應用pcr迴圈測序法能夠簡單、快速的進行基因序列的測定,但仍未能適應大規模dna序列測定的需要,而pcr迴圈測序法、熒游標記和自動測序儀的聯合使用成為大規模基因組測序的主要技術。

該技術是採用熒游標記引物或雙脫氧核苷三磷酸,反應產物經聚丙烯醯胺凝膠電泳後,經特定的dna序列分析儀和分析系統處理待測的dna序列。它的應用減輕了dna序列測定的工作量,提高了測序的效率。

基因組測序的具體過程

5樓:匿名使用者

比較常用的鳥槍法是先將基因組用酶切打斷成很多的碎片,之所以這麼操縱是因為目前的測序只能測小片段,而不能測大片段。

把這麼多的小片段測完後所面臨的一個問題是組裝,因為片段與片段之間存在著重疊,根據這些重疊就可以確定這些片段的先後順序(當然說起來好像很簡單,但是實際操縱起來非常複雜,因為基因組上有很多的重複序列,會使得片段與片段之間有很多組裝的可能性,這個時候還需要藉助一些數學的演算法)

基本過程就是這樣。目前基因組測序比20年前人類基因組剛起步時已經有了長足的進展,越來越多的先進測序技術得以發展。

具體的可以參考一下朱玉賢主編的現代分子生物學

6樓:匿名使用者

講起來很複雜哈,簡單來說,就是邊合成邊測序,把所要測序的序列通過各種手段來建庫,然後加上5『和3』都加上接頭,放在一個小玻璃片一樣的晶片上,上面一般是8個lane,把樣品加入到lane上之後和上面長好的接頭序列相結合(之前的建庫時加的接頭與之反向互補),然後再經過pcr擴增的過程形成一個dna簇,然後再進行新一條鏈的合成,在此合成過程中邊合成邊測序,沒加上去一個鹼基,機器就讀一次,根據其發到熒光來判斷加的是那種鹼基,這樣就能得到所要的序列資訊了。

測序會有誤差的,就好比pcr擴增迴圈多了也會有誤差一樣,假如說在第一百個鹼基合成時其誤差是99.9%,那下一個的誤差就是99.9%*99.

9%.....依次以指數形式遞增,到一定程度後測得的序列就不可靠了,所以會有一個極限,現在solexa的極限貌似比之前的150bp要長了。

當然以上都是指的solexa的平臺,454是焦磷酸測序原理,就又是一種方式了,這種方法得到的可靠序列長度之前說是500bp以上,現在估計都能測通1000bp了。

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