1樓：匿名使用者
最後一步煮沸以後，抗體和抗體結合的蛋白都變性了，從瓊脂糖珠上脫落下來，所以有人直接就連珠子帶上清就去電泳，瓊脂糖進不了膠。或者為了樣品跑出來好看，你直接轉速再高點，甩一下，讓大部分柱子都沉底，取上清電泳就行。
一般都用上樣緩衝液煮沸了，珠子上不剩什麼了。
免疫共沉澱定量問題求助
2樓：匿名使用者
真核生物的基因組dna以染色質的形式存在。因此，研究蛋白質與dna在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, chip） 是目前唯一研究體內dna與蛋白質相互作用的方法。
它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－dna複合物，並將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段，然後通過免疫學方法沉澱此複合體，特異性地富集目的蛋白結合的dn**段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與dna相互作用的資訊。chip不僅可以檢測體內反式因子與dna的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關係。而且，chip與其他方法的結合，擴大了其應用範圍：
chip與基因晶片相結合建立的chip-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；chip與體內足跡法相結合，用於尋找反式因子的體內結合位點；rna-chip用於研究rna在基因表達調控中的作用。由此可見，隨著chip的進一步完善，它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。
染色體免疫共沉澱（chromatin immunoprecipitation，chip）是基於體內分析發展起來的方法，也稱結合位點分析法，在過去十年已經成為表觀遺傳資訊研究的主要方法。這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾。chip不僅可以檢測體內反式因子與dna的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾 與基因表達的關係。
近年來，這種技術得到不斷的發展和完善。採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及**神經系統紊亂等疾病的主要通路的一種非常有效的工具。
文獻中常有western blot和免疫沉澱結合在一起做的圖，可是在下看不同，請幫忙看看這種圖怎麼看呀？
3樓：匿名使用者
圖頂部的「+」和「-」分別代表是否表達載體蛋白以及載體蛋白的相關資訊；
一般標有"tcl" "wcl" "lysates"或"ib:**"代表了對相對應過表達載體的表達情況的檢測（如果沒有表達那麼免疫沉澱就白做了）"anti-**"和"ib:**"裡的「**」則是顯出條帶的抗體，一般與過表達載體的標籤對應，比如「ha」或者「myc」，「gfp」等等，比如第一個圖中，用ha的抗體顯出了1、3、4泳道帶ha標籤的rock2，說明rock2有表達；
最重要的就是剩下的ip圖了，ip圖一般都有兩個，一個用來說明沉澱下來了蛋白1，另一個圖用來說明沉澱下來了與蛋白1存在相互作用的蛋白2。以第一個圖說明，「ip:anti-myc」是說沉澱蛋白1用的抗體是「myc」，因此帶myc標籤的mdpr2作為蛋白1被沉澱下來，跑膠後用myc的抗體顯出了條帶，同一塊膠轉的膜再用ha的抗體可顯出與蛋白1有相互作用，一同被沉澱下來的蛋白2，因此圖1表示rock2與mdpr2存在相互作用。
有什麼不懂的還可以問我，謝謝！
請教gst pull-down assay和免疫共沉澱的區別
4樓：蝸牛喜歡符豬
gst pull-down一般指用一個帶gst標籤的重組蛋白，與目的蛋白進行孵育，最後用結合gst的beads拉下相互作用複合物。
免疫共沉澱一般是用某一蛋白的抗體，在細胞裂解液中與相應的蛋白結果，用protein a/g將抗原抗體複合物拉下，最後在拉下的複合物中檢測目的蛋白的實驗。
二者都是用於檢測蛋白相互作用的實驗。
區別是pull-down一般是驗證 體外 相互作用；免疫共沉澱一般用於檢測細胞水平的 體內 相互作用。
免疫共沉澱的缺點
5樓：北京索萊寶科技****
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；
（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋樑作用；
（3）必須在實驗前**目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若**不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
（4）靈敏度沒有親和色譜高。
免疫共沉澱：
免疫共沉澱（co-immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
免疫共沉澱的注意事項
(1) 確保共沉澱的蛋白是由所加入的抗體沉澱得到的，而並非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助於避免汙染的發生；
(2) 要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中新增抗體後不會引起共沉澱；
(3) 確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由於細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。
6樓：▆▆▆丈
（1）可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；
（2）兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋樑作用；
（3）必須在實驗前**目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若**不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
（4）靈敏度沒有親和色譜高。
什麼是染色質免疫共沉澱技術（chip）？
7樓：一碗湯
染色質免疫共沉澱技術是在保持組蛋白和dna聯合的同時，通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體，染色質被切成很小的片斷，並沉澱下來的技術。
這項技術主要用來分析目標基因有沒有活性、或者分析一種已知蛋白**錄因子）的靶基因有哪些。該技術主要應用於以下幾方面：
1.組蛋白修飾酶的抗體作為「生物標記」
2.轉錄調控分析
3.藥物開發研究
4.有絲**研究
5.dna損失與凋亡分析
擴充套件資料：
實驗步驟：
1、細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-dna，蛋白質-rna交聯，形成生物複合體，防止細胞內組分的重新分佈。甲醛的交聯反應是完全可逆的，便於在後續步驟中對dna和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實驗而定。
值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響chip結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不完全，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。
2、染色質斷裂
交聯後的染色質可被超聲波或micrococcal nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利於抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響chip的效率。
所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程式，保證低溫。另外，超聲探頭要儘量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。
技術應用：
1、micrococcal nuclease可以將染色質切成一到幾個核小體，比超聲波處理的結果更精緻，更均一。另外，酶反應的條件比較溫和，對dna和dna-蛋白複合物的損傷較小，而且蛋白不易變性。酶處理染色質適用於新鮮的細胞或組織樣品和冰凍樣品。
在研究組蛋白時，經常採用沒經過甲醛固定的native chip（n-chip）的研究方法。
因為n-chip沒經過甲醛固定，超聲波處理會打斷組蛋白和dna的結合，所以只能選擇酶處理染色質的方法。對於甲醛固定的樣品，一般選擇超聲波處理方法。也有研究人員使用酶處理的方法研究甲醛固定較溫和的樣品。
2、染色質免疫沉澱的dna適用於多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可採用狹縫雜交（slot blot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉澱的dna雜交，來驗證目的蛋白與dna靶序列的特異性結合。
還可以根據靶序列設計引物，用半定量pcr的方法進行測定，或採用real-time pcr方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可採用southern雜交。但因為免疫沉澱的dna量較少，所以在研究時通常要用pcr方法擴增dna探針，再進行整個基因組掃描。
3、目前，隨著人類基因組測序工作的基本完成，研究目的蛋白和整個基因組的相互作用逐漸成為研究的熱點。由於基因組中的資訊量非常大，上述常規方法通常無法滿足科研的需要。近年來發展起來的chip-chip技術將基因組dna晶片（chip）技術與染色質免疫沉澱技術（chip）相結合，為研究目的蛋白與整個基因組相互作用提供了可能。
chip-chip 技術通過標記染色質免疫沉澱富集的dn**段，和另一個被標記不同探針的對照組樣品一起，與dna晶片雜交，再利用各種生物資訊學方法對收集到的訊號進行分析，具體的實驗步驟請參考dr. richard young在nature protocols上的文章。
chip-chip技術已經被廣泛應用於研究轉錄因子在整個基因組中的訊號網路，染色質修飾機制在基因組中的調控，dna的複製，修復以及修飾，基因的轉錄與核運輸等諸多方面。
4、染色質免疫沉澱技術還可用於分析兩種蛋白共同結合的dna序列，即chip rechip方法。chip rechip是在第一次chip的基礎上不解交聯，而繼續進行另一個目的蛋白的免疫沉澱，從而得到與兩種目的蛋白都結合的dna序列。
值得注意的是，因為通過兩次免疫沉澱富集的dna量比較少，所以在分析時通常要把多次免疫沉澱的dna濃縮後再進行操作。
5、隨著染色質免疫沉澱技術受到廣泛的關注，運用該技術發表的文章也逐漸增多，大家越來越多的開始關注如何改進chip的方法。millipore最新推出的magna chip試劑盒，利用磁珠分離dna-蛋白-抗體複合物，提高了chip的效率，簡化了操作的過程，縮短了實驗的時間，還為同時進行多個目的蛋白的研究提供了可能，是經常使用chip技術的研究人員的理想選擇。
6、近年來chip技術也被用於研究rna-蛋白的相互作用，其原理與dna類似，也包括甲醛固定，超聲波破細胞，免疫沉澱，交聯逆轉，rna純化和rna鑑定等步驟。所不同的是，交聯逆轉只用proteinase k，要進行rna純化和不含rnase的dnase處理，分析時用rt-pcr，晶片雜交要用cdna晶片等。
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