1樓：匿名使用者
用於流式檢測的全血需要用edta抗凝（抽血時使用bd的紫色蓋抽血管），抽血後不要冷藏或者冷凍。室溫下儲存24小時內完成檢測。如果血樣超過72小時，就不能再用於流式檢測了。
流式細胞儀檢測的原理
2樓：匿名使用者
很簡單的啊。
流式細胞儀資料分析
5.1 資料採集及顯示
光訊號轉換成電壓脈衝後，再通過模數轉換器轉換成為計算機能夠儲存處理的數字訊號。 流式細胞儀的資料以fsc標準格式儲存，該標準由「分析細胞學協會」制定。
根據fsc標準，資料儲存格式應包括三個檔案：樣本獲取檔案，資料設定檔案和資料分析結果。 4引數（fsc，ssc，fitc和pe）的單細胞分析會生成8位資料。
當單個樣品累計收集到10000個細胞時，fcs資料檔案為80kb。
資料採集儲存完畢後，細胞亞群可以幾種不同格式顯示。單引數如fsc或fitc（fl1）可使用直方圖，橫軸表示熒光通道。縱軸表示在該通道內收集到的細胞數量（如圖5-1）。
處在同一通道的每一細胞均符合該通道的訊號值，而且具有相同的訊號密度。通道右側訊號的熒光強度明顯高於左側，越靠右側熒光亮度越強。 圖5-1 流式資料分析圖
雙引數可在二維散點圖中同時顯示，x軸顯示通道1（fl1），y軸顯示通道2（fl2）。3維圖通過x，y，z三個軸分別顯示每個通道的細胞量（如圖5-1）。
習題：資料採集及顯示
1 在直方圖中橫軸和縱軸分別表示 。
2 二維點圖用於顯示 引數。
3 在cellquest軟體中3維圖中z軸代表 。
5.2 設門
通過設門的方法可以定義細胞亞群的區域。如：血樣本是混合細胞群，如果想單獨分析淋巴球細胞，可根據fsc或細胞大小，在fsc，ssc的散點圖中設門，其資料結果只反映淋巴細胞亞群的熒光特性。
圖5-2 全血樣本中淋巴細胞亞群的資料分析圖
習題：設門
1 設門的方法通常用於分析樣本內的指定細胞。（對 錯）
5.3 細胞亞群的資料分析
資料分析包括從點圖中的list-mode檔案中顯示資料,然後統計點圖中的細胞分佈情況。如前所述，分別有幾種形式的點圖用於顯示資料，而且可通過設門的方法區分指定的細胞亞群。 如圖5-3所示，在淋巴細胞亞群周圍設門，以單獨分析或分選該亞群細胞。
圖5-3 選定淋巴細胞亞群設門
門內細胞的資料結果可在隨後的圖中顯示。在下面的例項中，我們將詳盡闡述細胞亞群百分含量的不同分析方法。 我們可以通過單引數直方圖，二維點圖和三維圖來分析結果。
單引數直方圖可定位邊界，二維點圖可設定象限標誌。如果需要，還可以建立資料統計表以輸出結果。 直方圖可直觀單個引數的細胞數量。
陰性對照用於決定直方圖中單引數的左右邊界（見圖5-4）。左圖中m1為陰性對照峰。右圖中m2為cd3 fitc陽性峰。
圖5-4 陰性對照峰m1（norm001）和cd3 fitc陽性峰m2（norm002） 圖5-5的統計結果表明，整個事件共記錄了6000個細胞，門內淋巴細胞2891個。其中m1（陰性）細胞619個，m2（cd3陽性）細胞2272個細胞。淋巴細胞亞群cd3陽性百分含量的統計結果為：
m2：2272/2891=78.59%。
圖5-5 直方圖統計結果
二維點圖以雙引數顯示結果，每個點表示一個或多個細胞。圖5-6為陰性對照圖，用於設定陰性對照邊界，全圖劃分為四個象限，以區分陰性細胞、單陽性細胞以及雙陽性細胞。左下象限（ll）為雙陰性細胞，左上象限（ul）為y軸陽性細胞（cd19 pe），左下象限（lr）為x軸陽性細胞（cd3 fitc），右上象限（ur）為雙陽性細胞（cd19+/cd3+）。
圖5-6 陰性對照組(norm001)和cd3 fitc/cd19 pe雙染樣本(norm002) 如圖5-7所示，淋巴細胞亞群雙陽性細胞（cd19+/cd3+）的百分含量為：296/2839=10.43%。
圖5-7 散點圖統計結果 另一個分析方法是劃定區域，也就是設門。我們可以用不同形狀的繪圖工具定義所選區域（如圖5-8所示）；然後統計該區域內指定細胞亞群的百分含量。在圖5-9中，r4門內為cd4陽性，cd3陰性的淋巴細胞亞群，其結果為：
40/2866=1.40%。
圖5-8 cd3 fitc/cd4 pe 雙染樣本分析圖 圖5-9 cd3 fitc/cd4 pe 雙染樣本資料統計結果
這種方法在分析不同的供體細胞時存在一個缺陷，因為如果事先定義好細胞亞群的區域或邊界，在隨後的檔案中，下一個樣本的細胞亞群位置會發生變化，這就需要操作者重新調整區域或邊界位置。 為避免這種情況的發生，我們採用一種稱為叢集分析（cluster analysis）的新方法。bd公司的multisettm 和attractorstm軟體就屬於叢集分析軟體。
該軟體的特點是會隨著整個細胞亞群的移動而移動，自動變換區域或邊界到相應的細胞亞群位置（見圖5-10）。
圖5-10 使用attractors分析軟體時二維點圖的前後變化對比
5.4 流式細胞儀的其它應用以及資料分析
這些分析方法通常適用於計算離散細胞群的百分含量，對於分析單克隆細胞株分子是否呈陽性並不適用。因為單克隆細胞株是單個細胞群，在大多數情況下，既不是100%陰性，也不是100%陽性，所以我們通過幾何均值法和中位法統計細胞熒光密度和陽性率。如果樣本的統計結果遠遠大於陰性對照組，那麼我們認為其結果是陽性的，兩者間的差異越大，說明細胞的表達越高，陽性率越高。
如圖5-11所示，左圖為單細胞群的散射光訊號，右圖為陰性對照組和兩種不同抗體染色樣本的峰疊加圖。每個峰的幾何均值分別為2，5和20（從左至右）。
圖5-11 單細胞株分析圖 除檢測陽性率，幾何均值法和中位法還用於分子（接合子）定量分析。
quanticalctm軟體就是使用中值法計算每個細胞的抗體結合位點數。如圖5-12所示，y軸上的圓圈代表從標準曲線獲取的資訊，用於計算每個細胞的接合點位數。 圖5-12 使用quanticalc軟體計算每個細胞的抗體結合位點數 我們使用modfit lttm軟體進行dna定量分析。
因為dna峰（g0/g1期，s期和g2m期）不是離散的，所以我們對曲線以下的面積進行積分，以得到每個細胞亞群的百分含量結果。
圖5-13 細胞週期的dna直方圖
習題：資料分析
1二維點圖和一維直方圖的作用分別是什麼？
2 見圖5-4和圖5-5，cd3陰性和陽性的百分含量分別是多少。
3 ll象限代表雙陽性細胞亞群。（對 錯）
4 見圖5-6和圖5-7，淋巴細胞（cd3+/cd19-）的百分含量是多少。
5 只能使用矩形設定細胞區域範圍。（對 錯）
6 使用區域設定法分析樣本有哪些不足。
7 避免細胞亞群移動的分析方法是什麼。
8 在定量分析中我們使用哪些分析方法檢測陽性率。
5.5 cellquest和cellquest pro軟體使用
cellquest和cellquest pro軟體是目前運用最為廣泛的流式細胞儀採集及分析軟體。它執行於蘋果電腦上，優質的向量圖顯示使得操作介面特別優美。現最新的微軟公司的vista軟體也是仿蘋果作業系統介面的，可想而知在使用cellquest和cellquest pro時的強大功能及視覺質感。
cellquest和cellquest pro軟體主安裝在bd facscalibur型流式細胞儀上。
1．軟體資料流程
在cellquest和cellquest pro軟體的資料流分為二個部分：方案和資料包。方案是指使用者可以建立採集或分析所需的直方圖或散點圖、設門並定義門與門、門與圖之間的邏輯關係。
可以使用方案進行資料採集或分析以往已有的資料。每個採集方案分析樣本後會生成資料包，該資料包中包括了樣本中每個顆粒在各個檢測引數上的數值，格式為fcs2.0或fcs3.
0。資料包必須由方案檔案開啟，無法單獨顯示，或者可由第三方軟體進行分析，如winmdi。
2.軟體與儀器的連線
流式細胞儀需要加電開啟後會向計算機發出資訊，所以如要進行實驗需要先開啟流式細胞儀，然後再開啟計算機。
1、 先開儀器後開計算機，以確保儀器和計算機之間的正常通訊。
2、 在蘋果選單下點選cellquest和cellquest pro軟體。
3、 從aquire選單下選擇con*** to cytometer。
3．方案與資料之間的關係
cellquest和cellquest pro軟體的方案與資料相互獨立儲存，資料包可以由任一方案檔案進行分析，分析後不改變資料包中的任何資料。cellquest和cellquest pro軟體中方案內的直方圖或散點圖有三種狀態：acquire，analysis和acquire-analysis。
當圖的屬性為acquire時，此圖只限於採集下用，即只當進行檢測時它才能顯示顆粒；
當圖的屬性為analysis時，此圖只限於分析已儲存的資料包，它不能用於採集資料。
當圖的屬性為acquire-analysis時，此圖即可用於採集資料也可用於分析已有資料。
所以方便起見，我們一般將方案中的直方圖或散點圖全部設為acquire-analysis屬性。
cellquest pro cellquest
4．方案的建立
a選擇實驗引數
預設情況下，facscalibur流式細胞儀開機後只開啟一根鐳射器，及五個引數供選擇使用：fs、ss、fl1、fl2、fl3。當我們要使用第二根鐳射器及fl4通道時需要勾選fl4的選項，儀器自動開啟633nm鐳射器。
b,建立散點圖或直方圖，命名座標
cellquest pro軟體主要工作介面，軟體類似於office word的工作面，可在a4大小的頁面上進行編輯建立各種直方圖或散點圖。
在cellquest軟體下，需在選擇plot選單，選擇format來開啟圖的屬性對話方塊，其中包括了關於該圖所有選項。
建立好直方圖或散點圖後，我們需要對所選的引數進行命名，如不修改軟體自動命名為fs、ss、fl1、fl2、fl3和fl4。
在選單上選擇acquire欄目，選擇parameter description，可出現關於檔案儲存和引數命名的對話方塊。在這個對話方塊中用p字母來代表每個引數，並在此對每個採集引數進行命名，fl1為cd3fitc，fl2為cd4pe……。
c,設門並建立門與圖之間的關係
r與g的關係
r是region的首個字母，region一般是指一個閉合形的區域，如矩形區、自由區和圓形區。區域與區域之間可以進行邏輯運算，如and、or、not等關係。當區域進行運算時軟體引進了算術公式的管理概念：
gate實際了個代數式，簡稱g，其運算式預設如下：
g1 = r1，或g2=r2
當我們要進行邏輯運算時，可變更為g1=r1 and r2。此時g1就成了一個算術結果了。
g1=r1 and r2
g2=r1 not r2
g3=r1 or r2
region list管理門，可以重新命名或刪除門。gate list是對門進行邏輯運算和標識顏色的工具。
建立門與圖之間的關係
開啟要編輯的直方圖或散點圖的屬性對話方塊，選擇gate選項，選擇門即可。
d，顯示統計引數
5．儀器的操作
當計算機與流式細胞儀聯機後便會出現以下采集控制框：
在有關儀器操作所有控制選項框都在cytometer下拉選單下，同時按住「蘋果」鍵及1、2、3、4便可調取所有控制框：
6．檔案的儲存及呼叫
實驗或分析過程中所建的方案可以儲存下來，通file下拉選單可以儲存這些方案檔案：
如要開啟這些分析方案只需雙建方案圖示即可；方案可以分析以往的資料包（前提是方案中的直方圖或散點圖都已定義成acquire-analysis屬性），有兩種方案開啟以往的資料：
方法一：選擇直方圖或散點圖，開啟該圖的屬性框（plot->>format），見下圖：
在以上紅色框標註的地方選擇要分析的資料包。
方法二：選中方案中所有的直方圖或散點圖，開啟plots選單，選擇chang data file，開啟要分析的資料包。
附：cellquest pro軟體所有下接選單
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