1樓：匿名使用者
（1）質粒dna的質量和濃度： 用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。
對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。 （2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃ （3）細胞的生長狀態和密度 最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。 （二）感受態細胞轉化中的影響： 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。
所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
大腸桿菌感受態細胞製備時的cacl2濃度到底是多少呢？
2樓：月神
孫小刀3個月前覺得大腸桿菌感受態細胞的製備實驗簡單一般實驗室喜歡一下製備大量感受態儲備。。。所以工作量比較大，製作過程到處都有，大多數人也是用化學法做。注意無菌，低溫等試驗環境，最主要是耐心。。。
3樓：廉聽雲薄朝
（1）質粒dna的質量和濃度：
用於轉化的質粒dna應主要是超螺旋態的，轉化率與外源dna的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源dna的量過多或體積過大時，則會使轉化率下降。一般地，dna溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5%，1ng的cccdna即可使50ul的感受態細胞達到飽和。對於以質粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉化效率低，實驗證明，大於30kb的重組質粒將很難進行轉化。
此外，重組dna分子的構型與轉化效率也密切相關，環狀重組質粒的轉化率較分子量相同的線性重組質粒高10~100倍，因此重組dna大都構成環狀雙螺旋分子。
（2）感受態細胞的質量：
所用的cacl2等試劑均需是最高純度的，並用最純淨的水配製，最好分裝儲存於4℃
（3）細胞的生長狀態和密度
最好從-70℃或-20℃甘油儲存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。不要用已經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×107個左右為佳。
即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的od600控制。對tg1菌株，od600為0．5時，細胞密度在5×107個/ml左右。（應注意od600值與細胞數之間的關係隨菌株的不同而不同）。
密度過高或不足均會使轉化率下降。
（二）感受態細胞轉化中的影響：
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、dna酶或雜dna所汙染，否則均會影響轉化效率或雜dna的轉入。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。
大腸桿菌感受態細胞製備為什麼要用cacl2處理細菌
4樓：阿魯巴星人
ca離子沉聚在細胞膜表面會使得細胞膜呈一種液晶的狀態，這種狀態便於在熱激條件下形成縫隙，便於轉化質粒。
大腸桿菌感受態細胞製備中，第八步中氯化鈣溶液中甘油的作用是什麼
5樓：匿名使用者
菌種儲存採用甘油種結合超低溫（-70℃）儲存的方法，即用無菌甘油懸浮工程菌，並使甘油終濃度為30 %（v/v），所獲物即為工程菌的甘油種。低溫可使工程菌的生命活動處於非活躍狀態而能較長時間儲存細胞活力、減少基因變異，而30%的甘油可保護菌種的細胞膜系統在冷凍與解凍迴圈中不被破壞而起到保護作用。
如何製備大腸桿菌感受態細胞
6樓：匿名使用者
（1）挑取大腸桿菌單菌落，接種於5 ml無抗生素的lb液體培養基中，37℃下振盪培養13h，至對數生長後期。將該菌懸液以1:50 的比例接種於100 ml lb 液體培養基中，37℃振盪培養2-3h至od600＝0.
5。（2）在無菌條件下將培養液轉入離心管中，冰上放置10 min，使培養物冷卻至0℃，然後4℃，4000rpm離心10min；
（3）棄去上清，倒置1 min，以便將培養液流盡；
（4）用冰預冷的0.1 mol/l的cacl2溶液10 ml輕輕懸浮細胞，充分混勻，冰上放置30 min後，4℃下4000rpm離心10min；
（5）棄去上清，並倒置1 min，以便最後的痕量培養液流盡；
（6）加入4 ml預冷含15%甘油的0.1 mol/l的cacl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；
（7）感受態細胞100 μl分裝，貯存於-70 ℃儲存備用。
用氯化鈣怎樣製備新鮮的大腸桿菌感受態細胞？
7樓：筆袋dc梞
這屬於專業問題啦 下面的簡單方案是clhen等(1972)所用方法的變通方案，常用於成批製備感受態細菌，這些細菌可使每微克螺旋質粒dna產生5x106-2x107 個轉化菌落，這樣的轉化效率足以滿足所有在質粒中進行的常規克隆的需要。該方法完全適用於大多數大腸桿菌菌株，並且比方案i快速，重複性更好。該法制備的感受態細胞可貯存於-70℃，但儲存時間過長會使轉化效率在一定程度上受到影響。
1、從於37℃培養16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm)，轉到一個含有100ml lb或sob培養基的1l燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養約3小時(旋轉搖床，300轉/分)。為得到有效轉化，活細胞數不應超過108細胞/ml，可每隔 20-30分種測量od600值來監測培養物的生長情況。
在菌株與菌株之間，od600值和每毫升中活細胞數間的關係變化很大，因此有必要通過測量特定大腸桿菌菌株的生長增減物在生長週期的不同時相的od600值，並將各濃度的增減物鋪於無抗生素的lb瓊脂平皿以計算每一時相的活細胞數，從而使分光光度讀數得到標化。 2、在無菌條件下將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50ml聚丙烯管(falcon 2070)中，在冰上放置10分鐘，使培養物冷卻至0℃。切記：
下述所有步驟均需無菌操作。 3、於4℃用sorvall gs3轉頭(或與其相當的轉頭)以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 4、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。
5、以10ml用冰預冷的0.1mol/l cacl2重懸每份沉澱，放置於冰浴上。我們發現將1mol/l cacl2貯存液用純水(mille-q級或與其相當的級別)配製以10ml小份貯存於-20℃煞是方便。
製備感受態細胞時，取一小份融化，用純水稀釋至100ml，用nalgene濾器(0.45μm孔徑)過濾除菌，然後驟冷到0℃即可。對於大多數大腸肝菌菌株(除mc1061外)，在這一步採用tfb代替氯化鈣可得到相同的或更好的結果。
6、於4℃以4000轉/分離心10分鐘，以**細胞。 7、倒出培養液，將管倒置1分鐘以使最後殘留的痕量培養液流盡。 8、每50ml初始培養物用2ml用冰預冷的0.
1mol/l cacl2[或tfb，見步驟5，注]重懸每份細胞沉澱。此時，可將細胞分成小份，放於-70℃凍存。在這些條件下，儘管長期儲存後轉化效率會稍有下降，但細胞仍可保持處於感受態。
dagert和ehrlich(1979)曾表明細胞可以於4℃在cacl2溶液中儲存24-48小時，在貯存的最初12-24小時內，轉化效率增加3-5倍，然後降低到初始水平。 9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加dna(體積∞10μl，dna∞50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘。 10、將管放到預加溫到42℃的迴圈水浴中放好的試管回上，恰恰放置90秒，不要搖動試管。
11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1-2分鐘。 12、每管加800μl soc培養基。用水溶將培養基加溫至37℃，然後將管轉移到37℃搖床上，溫育45分鐘細菌復甦，並且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
如果要求更高的轉化效率，在復甦期中，應溫和地搖動細胞(轉速不超過225轉/分)。 13、將適當體積(每個90mm平板可達200μl)已轉化的感受態細胞轉移到含20mmol/l mgso4和相應抗生素的sob瓊脂培養基上。如培養物體積太小(〈10μl)。
可再加肉湯培養基，用一無菌的彎頭玻棒輕輕地將轉化的細胞塗到瓊脂平板表面。如在一個90mm平板上鋪200μl以上的感受態細胞，應離心濃縮細胞，然後用適量soc輕輕重懸細胞。如用四環素抗性作為選擇標記，全部的轉化混合物可以鋪在一個單獨的平皿上(或鋪在軟瓊脂中)。
然而如選用氨苄青黴素抗性，則只能將一部分培養物(根據實驗決定)鋪在單獨的平皿上。氨苄青黴素抗性功的增加與平皿上所加細菌數的增加並無線性比例關係，這可能是因為被抗生素殺死的細胞可釋放生長掏物質的緣故。 14、將平板置於室溫直至液體被吸收。
15、倒置平皿，於37℃培養，12-16小時後可出現菌落。如檢查氨苄青黴素抗性，用轉化細胞鋪增板時密度較低(每個90mm平板不超過104菌落)，於37℃培養平板時不應超過20小時。氨苄青黴素抗性的轉化可將β-內醯胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍區域中的抗生素。
這樣，鋪平板時密度太高或培養時間太長都會導致出現對氨苄青黴素敏感的衛星菌落。在選擇培養基中不用氨苄青黴素而改用羧苄青黴素，以及將抗生素濃度從60μg/ml增至100μg/ml，可使情況有所改善，但不能徹底**之。
大腸桿菌感受態細胞製備中，第八步中氯化鈣溶液中甘油的作用是什
菌種儲存採用甘油種結合超低溫 70 儲存的方法，即用無菌甘油懸浮工程菌，並使甘油終濃度為30 v v 所獲物即為工程菌的甘油種。低溫可使工程菌的生命活動處於非活躍狀態而能較長時間儲存細胞活力 減少基因變異，而30 的甘油可保護菌種的細胞膜系統在冷凍與解凍迴圈中不被破壞而起到保護作用。製作大腸桿菌感受...
大腸桿菌感受態細胞DNA轉化，為什麼沒有克隆菌生長
當然要先用液態不加抗生素的lb復甦好不好。不要糾結在轉化塗板的過程上 要麼就是你的質粒酶切完後 的片段不對 要麼就是你的膠 產物不對 你用什麼酶做的pcr？連t載體末端必須有a 感受態還有沒有用？最好轉個質粒驗證一下，做這個感受態是非常重要的。膠 的時候有沒有把wash buffer 蒸發乾淨？為什...
為什麼製備好的感受態細胞放冰箱過夜後,轉化率會提高
剛製作完成的時候，轉化率最高。然後放入冰箱，只要凍融過，轉化率就會下降，並且隨著儲存時間的增加而下降。製備出來的感受態細胞在什麼時候做轉化最佳 當場做出來的，當時做轉化，轉化效率最高。儲存在 80冰箱的感受態，儲存40天以後，感受態效率會有明顯下降。經轉化的感受態細胞，塗完板後，還有剩餘的菌液，為什...