1樓：羽動一生
你是在說轉化質粒後的菌液pcr嗎？酶切鑑定，或者是測序。
菌落pcr會出現假陽性結果嗎
2樓：匿名使用者
高手們好。最近做酶切連線轉化，最後做鑑定時，以菌落為模板進行pcr時可以見到有目的條帶;當把菌落接種到lb液擴菌後，以菌液為模板進行pcr時卻什麼東東都沒有?請問會是什麼原因啊?
多多指教啊!建議重新以菌落為模板進行pcr檢測，再重新以菌液為模板進行pcr檢測，因為菌落或者菌液pcr假陽性的機率還是比較高的。但如果還是出現以上結果，推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的，此時建議再提質粒做pcr檢測和酶切檢測來徹底證明你的目的片段是否真正與載體連線成功。
個人的見解希望對你有所幫助，也期望高手們批評指正!我覺得菌落pcr效果很好，雖然有假陽性的可能，但是只要是做出來，有目的條帶一般是對的，你為什麼還要用菌液做pcr?你還不如搖菌後提取質粒然後用質粒pcr或者酶切。
既然你說到這個問題了，我覺得很有可能是你的質粒被稀釋了，因為在菌落中的濃度比較大。另外也有可能是你根本就沒有挑到正確的菌落來搖菌，所以就沒有質粒，怎麼能做出來。我覺得你做菌液的pcr和菌液的pcr必須是從單一的一個菌落挑出來的，如果不是，那肯定只有一個是正確的，我做過，只要是同一菌落不會有差錯。
你再試試看，祝你成功!謝謝各位高手的及時的回答。現在我都是挑單個菌落後搖菌，然後提取質粒，然後以質粒為模板做pcr，陽性的質粒再酶切進行鑑定，效果還可以。
再次謝謝大家!!!第二次看到這種觀點，不確定對不對，借道跟大家討論一下，不知道lcc有沒有文獻支援一下這種觀點?如果這種觀點正確，那我以前很多關於t載體的看法就錯了，所以很感興趣。
我一直以為外面的dn**段會被大腸桿菌分泌出來的核酸酶降解。 lcc_0 wrote:推測很可能是平板上殘留的連線液中的未連線上載體的目的條帶引起的說來也很奇怪，以前我就是挑菌後加到lb液後搖菌，然後以菌液為模板進行pcr，再以陽性管提取質粒進行酶切鑑定，排除陰性管，這樣可以少提一些質粒。
最近菌液pcr總是陰性，所以就直接提質粒進行鑑定了。其中原因真的不知道是什麼?我也遇到過，也許是塗抹的轉化產物導致的加陽性(菌落pcr)。
各位大大，我倒是碰到過菌液pcr是陰性，但是有質粒的情況，酶切也正確。一般我以為質粒抽屜和酶切鑑定是最保險的。pcr假陽性。
假陰性的概率都很高。菌液的問題在於鹽!鹽會干擾pcr。
如果用菌液的話，可以用水洗滌離心幾次，然後重懸於水，就可以了。 題外話:最近菌落pcr，陰性和陽性對照經常不擴增，而樣品擴增，鬱悶啊。
3樓：匿名使用者
條帶兩端上揚這種情況在跑電泳很常見，一般把電壓調低點跑久點會改善，有時候膠沒有做好也會出現這樣的情況，注意拔梳子的時候一定要平衡。以前做克隆的時候，陰性對照模板用水擴增也出現過有條帶，就像你最後一個泳道。老闆說是汙染了，把所有的試劑全部換新的，而且加樣條件也非常注意，後來就沒有條帶了。
4樓：匿名使用者
菌落pcr的結果參考價值比較下，假陽性太厲害。還是以測序結果為準。可以在測序之前做一下質粒酶切驗證
菌液pcr的假陽性是什麼原因造成的
5樓：南京金益柏
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行 pcr 擴增時，擴增出的 pcr 產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。
需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，與引物互補後，可擴增出 pcr 產物，而導致假陽性的產生，可用巢式 pcr 方法來減輕或消除。
pcr中怎樣預防出現假陽性結果 5
6樓：匿名使用者
假陽性的現象就是在空白對照出現目的擴增產物，原因是靶序列或擴增產物的版交叉汙染。所以權，只要實驗過程中注意防止交叉汙染就行了。
做pcr實驗主要注意以下幾點：
1，操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外；
2，除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用。
3，各種試劑最好先進行分裝，然後低溫貯存。
7樓：匿名使用者
考慮假陽性的**，一個產物汙
染，這個是最嚴重的
，二是樣本間交叉汙染，專三是引物設計的不特屬異，針對第一種問題，建議使用udg酶，而且一定要嚴格管理實驗室，三個分割槽的物流**是怎麼樣要嚴格執行。樣本交叉汙染建議樣本提取過程中儘量避免使用煮沸裂解之類比較劇烈的手段，可以考慮磁珠提取，當然強陽性樣本磁珠也不行，這時最好是手工磁珠提取，因為有些廠家的半自動提取儀器很扯淡，比如西安天隆，混勻很劇烈容易產生交叉汙染，第三種情況就沒啥可說的，換對引物，好好比對一下。當然了，說起來很簡單，真要做起來非常難。
8樓：匿名使用者
不考慮操作問題（看一樓）。
你要設計好實驗，關鍵是引物選取。現在各大資料庫有很多資訊，可以blast一下。還有做菌落pcr檢測，最好可以用載體上的引物
(萬分火急)轉化子的菌落pcr原理是什麼?
9樓：樂觀的無
如果轉化成功的話，菌落裡的菌就含有你克隆的質粒載體了，用槍頭直接碰一下，然後作為pcr模板，就可以進行pcr擴增了。但是菌落pcr鑑定的假陽性率其實也不低，所以建議你挑取菌落擴培之後抽提質粒，進行酶切鑑定，這樣比較準確，酶切鑑定確認好之後再去測序以確定沒有鹼基突變或缺失。
你說的t7通用引物是指載體上的t7 promtor引物嗎？那只是一條引物啊，如果加上gbh下游引物的話，擴增出來的就是你連線進去的目的基因的長度了。
10樓：匿名使用者
跟普通pcr的原理一樣 只不過模板不同 如果已經成功轉化 則含有你的目的片段 就以這個目的片段作為模板來進行擴增
下面算式中，結果一定等於14的是其中20）ABC
a，抄 襲 2 2 4 4 不符bai合du要求 b，zhi 2 2 0，0 不符合要求 c，dao 2 2 4 14 符合要求 d，2 2 4 不一定等於1 4，不符合要求 故選 c 小學數學題 1 14.7 8.35 24.96 4.8 14 8 0.7 0.35 24 4.8 0.96 4.8...
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