1樓：順反子
該答案來自來自，**在下面，僅供參考。
引物設計需要注意的地方很多，在大多數情況下，我們都是在知道已知模板序列時進行pcr擴增的。
設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。引物分析軟體將試圖通過使用每一引物設計變化的預定值在這兩個目標間取得平衡。設計引用有一些需要注意的基本原理：
① 引物長度
一般引物長度為18~30鹼基。總的說來，決定引物退火溫度（tm值）最重要的因素就是引物的長度。有以下公式可以用於粗略計算引物的退火溫度。
在引物長度小於20bp時：[4(g+c)+2(a+t)]-5℃
在引物長度大於20bp時：62.3℃+0.41℃(%g-c)-500/length-5℃
另外有許多軟體也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化pcr反應，使用確保退火溫度不低於54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。
引物長度的上限並不很重要，主要與反應效率有關。由於熵的原因，引物越長，它退火結合到靶dna上形成供dna聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。
② gc含量
一般引物序列中g+c含量一般為40%~60%，一對引物的gc含量和tm值應該協調。若是引物存在嚴重的gc傾向或at傾向則可以在引物5』端加適量的a、t或g、c尾巴。
③ 退火溫度
退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物鹼基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使pcr的特異性增加；如果鹼基數較多，那麼可以適當減低退火溫度，是dna雙鏈結合。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響pcr的產率，但是理想情況下一對引物的退火
溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。
④ 避免擴增模板的二級結構區域
選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟體可以**估計目的片段的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△g）小於58.
6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2』-脫氧gtp取代dgtp對擴增
的成功是有幫助的。
⑤ 與靶dna的錯配
當被擴增的靶dna序列較大的時候，一個引物就有可能與靶dna的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用blast軟體進行檢測，
2樓：撒麼
基因表達載體的構建（即目的基因與運載體結合）是實施基因工
程的第二步，也是基因工程的核心。 將目的基因與運載體結合的過程，實際上是不同**的dna重新組合的過程。如果以質粒作為運載體， 首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。
然後用同
一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵，再加入適量dna連線酶，催化兩條dna鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連線起來，形成一個重組dna分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒dna分子結合，形成重組dna分子（也叫重組質粒）的。
3樓：匿名使用者
首先需要你瞭解你需要的真和表達載體的各方面是不是符合你的要求，一定要有mcs位點，然後對你要進行表達的基因測序並根據序列設計引物，因為要重組到載體上，所以你要在引物兩端各加上你所要用的限制酶的識別序列，這樣就可以重組上去了，如果只用一種酶切的話就要注意連線的方向了，如果是兩種酶的話就沒事了，對於過表達，你得根據你自己的研究物件來對基因就行修改，但重組的方法就不變。
怎樣構建目的基因表達載體
4樓：句月聽風
先看錶達載體有哪些合適的酶切位點，比如ndei,ncoi這樣識別序列有atg起始密碼子的，再看看目的基因含不含有這些位點，含有就不好連線了，挑好位點，計算下讀碼框是否正確，保證核糖體結合位點後的第一個atg與目的基因是間隔3的倍數個鹼基。下游的位點更好選，如果有6xhis標籤，想融合表達的話，就注意下要是同一讀碼框，同時利用載體的終止密碼子，如果沒有這樣的需要，就利用目的基因本身的終止密碼子好了。基本是這樣，具體還是看看書吧。
如何構建一個基因的過表達載體
5樓：風翼殘念
當拿到一個基因的dn**段後，就需要把它匯入一個載體，一方面長期儲存。另一方面也需要以載體為媒介將基因匯入受體細胞中。基因表達載體的構建是基因工程的核心。
常用的載體有細菌質粒，噬菌體和動植物病毒。其中質粒載體最常用。所謂載就是一個很長的環狀dna，攜帶一些基因，可以匯入細菌中自我複製，也可以從細菌中提取出來改造。
現在我們就需要把sun片段連到一個載體，用vectornti開啟，研究一下用哪個酶處理，這個載體需要用**a1這個酶切開，然後用sun連上，替換切下來的ccdb，這裡要用到兩個酶，一個**a1限制性內切酶切開，一個dna連線酶把新片段連上，植物轉基因載體和這些酶都是非常常用的試劑。
載體構建好之後需要把它們匯入大腸桿菌中複製，這裡就要用到大腸桿菌的感受態了，十把構建好的載體和感受態混合，然後放到42度熱水處理個1分鐘，再冰上放個3分鐘。
這時需要一些培養細菌的培養基來培養菌們，大腸桿菌這種菌很好養活，唯一需要注意的是，滅菌過後的培養基要小心儲存。把在冰上處理過的大腸桿菌放到培養基中培養一天，為了防止沒有轉入載體的菌也混進來，我們在載體上加入了一個抵抗抗生素的基因。
這樣我們在培養基中加入這種抗生素，在裡面就只有需要的大腸桿菌能生長了。最後得到了上億個攜帶著含有我們的sun基因的載體的大腸桿菌，這時就需要把質粒再提出來。
實驗室裡提質粒需要用專門的試劑盒，也可以簡化一下，先把菌液離心讓菌沉澱，然後再用水把菌打散，然後煮沸1分鐘再離心，取上清，上清中加乙醇讓dna析出，再離心讓dna沉澱，最後用水把dna溶解。這樣提出來的dna會有很多雜質以及細菌的基因組dna。
6樓：匿名使用者
用限制酶分別切割目的基因兩側及運載體，然後在dna連線酶的作用下就形成了基因表達載體。
7樓：紫耀星之軌跡
首先要用一定的限制酶切割質粒，使質粒出現一個缺口，露出黏性末端。然後用同
一種限制酶切斷目的基因，使其產生相同的黏性末端（部分限制性內切酶可切割出平末端，擁有相同效果）。將切下的目的基因的片段插入質粒的切口處，首先鹼基互補配對結合，兩個黏性末端吻合在一起，鹼基之間形成氫鍵，再加入適量dna連線酶，催化兩條dna鏈之間形成磷酸二酯鍵，從而將相鄰的脫氧核糖核酸連線起來，形成一個重組dna分子。如人的胰島素基因就是通過這種方法與大腸桿菌中的質粒dna分子結合，形成重組dna分子（也叫重組質粒）的。
原核表達載體和真核表達載體的區別
8樓：威海博銳化機
一、表達載體不同：
原核表達載體構建重組表達載體：
1、載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶（同引物的酶切位點）進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳後，用膠**kit或凍融法**載體大片段。
2、pcr產物雙酶切後**，在t4dna連線酶作用下連線入載體。
真核細胞表達載體之一為pegfp-n1載體，具有對方面的優點。pegfp-n1載體上攜帶有egfp蛋白表達基因。
二、表達實現方式不同：
真核表達載體具有neo基因，可以採用g418來篩選已成功轉染了該載體的靶細胞。這些特殊的結構可以實現目的基因在靶細胞內的穩定表達。
三、獲得目的基因方式不同：
pegfp-n1載體從結構上看，質粒具有很強的複製能力，可以滿足隨宿主細胞**時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是真核細胞表達載體保證目的基因穩定表達的因素之一。
原核表達載體獲得目的基因：
1、通過pcr方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），pcr迴圈獲得所需基因片段。
2、通過rt-pcr方法：提取總rna，以mrna為模板，逆轉錄形成cdna第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行pcr迴圈獲得產物。
9樓：匿名使用者
原核載體可以將真核基因表達，但是表達出來的蛋白是沒有活性的，因為缺少翻譯後修飾系統。。。真核的表達載體呢 由於比較大 不適合大量快速擴增，所以要在其載體上構建可以在原核生物 如大腸桿菌中複製的所需的複製原件 。。。。綜上 在應用的時候 要構建 穿梭質粒 可以穿梭於 原核和 真核 呵呵 還有就是 原核表達載體的基本元件和真核的有不同的地方 。。。。。
總覺得不夠正確答案 。。。。。有些人緣的蛋白在原核裡沒有蛋白翻譯後修飾，表達後沒有活性，這時候就得在真核裡表......
10樓：匿名使用者
主要是因為原核和真核表達系統所需的表達元件不同。
比如說啟動子，終止子在兩種表達系統中是不一樣的。
帶有真核表達元件的是真核載體，能在真核生物內表達；
帶有原核表達元件的是原核載體，能在原核生物內表達。
兩者都具有的為穿梭載體。
1)真核表達載體和原核表達載體就是能在真核生物或原核生物中表達的載體,它們一般都帶有能在真核生物或原核生物中表達的必需表達元件;
2)真核表達和原核表達的目的都是為了能夠大量獲得自己所需要的目的基因的表達產物,最好有生物活性,以便下一步的實驗需要.
3)原核表達載體一般只能在原核生物中表達外源基因,但有些穿梭載體可以分別在真核和原核生物中表達它們的表達元件.
真核過表達質粒，原核過表達質粒的區別~急求~~
11樓：學雅思
一、指代不同
1、真核過表達質粒：真核細胞表達載體之一為pegfp-n1載體，具有對方面的優點。pegfp-n1載體上攜帶有egfp蛋白表達基因。
2、原核過表達質粒：能攜帶插入的外源核酸序列進入原核細胞中進行表達的載體。
二、特性不同
1、真核過表達質粒：該質粒具有很強的複製能力，可以滿足隨宿主細胞**時跟隨胞質遺傳給新生的子細胞，這是真核細胞表達載體保證目的基因穩定表達的因素之一。
2、原核過表達質粒：啟動子是dna鏈上一段能與rna聚合酶結合並起始rna合成的序列，它是基因表達不可缺少的重要調控序列。沒有啟動子，基因就不能轉錄。
由於細菌rna聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動子。
三、載體構建不同
1、真核過表達質粒：，由238個氨基酸組成，分子量約為27kd。gfpgfp在包括熱、極端ph和化學變性劑等苛刻條件下都很穩定，用甲醛固定後會持續發出熒光，但在還原環境下熒光會很快熄滅。
2、原核過表達質粒：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），pcr迴圈獲得所需基因片段。
什麼是融合表達載體,怎樣構建目的基因表達載體
是指能與外源基因 目的基因 在體外重組，並能匯入在表達系統中進行高效表達的一類物質。融合載體是指 動物或者是植物的細胞 經過某種培養 經過酶的作用 使其細胞相融合 構成的新細胞 這就是融合載體 其中涉及到植物細胞培養 或者是動物細胞培養技術 怎樣構建目的基因表達載體 先看錶達載體有哪些合適的酶切位點...
載體構建時，如何區分質粒是真核表達還是原核表達，二者的啟動子
這個做你就有點盲目了，我覺得你應該先確定你要原核表達，還是真和表達，確定後，在選擇質粒。正如你所說載體是可以構建的，所以質粒作為載體，其啟動子也是可以構建的，現在實驗室往往自己構建所需要的載體進行表達，就是我需要什麼樣的質粒，我就構建什麼樣的質粒。明白哇。質粒的啟動子不同之處在於原核和真核表達體系的...
酶將質粒載體與目的的基因構建為基因表達載體，有幾
基因表達載體的構建 即目的基因與運載體結合 是實施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其構建目的是使目的基因能在受體細胞中穩定存在，並且可以遺傳給下一代，同時，使目的基因能夠表達和發揮作用。將目的基因構建在表達載體上的方法有哪些 有兩種常用的方法。第一種是直接將pcr擴增的基因片段酶切，然後連線到...